La Cappella del Santissimo ospita l'immagine di Nostra Signora, la Vergine del Sagrato, patrona di Toledo, chiamata così poiché è collocata a protezione del Sacrarium, ciò che è sacro, luogo delle reliquie dei santi venerati nella Cattedrale.
L’immagine della Patrona di Toledo, seduta su un trono in argento dorato, opera del fiorentino Virgilio Fanelli della seconda metà del XVII secolo, è una scultura lignea della fine del XII secolo. Nel 1465 fu rivestita d'argento del suo colore, le sue vesti furono adornate con una fimbria d'oro con incastonature in pietre preziose. La Vergine, seduta in posizione frontale, tiene sulle sue ginocchia il Bambino, anch'egli rivestito d'argento, che benedice con la mano destra e sostiene una sfera con croce nella sinistra.
Secondo la tradizione, l'immagine della Vergine del Sagrato, occultata ai musulmani stabilitisi nella penisola, fu scoperta dopo la riconquista di Toledo da parte dei cristiani nel 1085 nel Pozzo della Vergine, sito nel chiostro della Cattedrale, dalle cui acque emerse con una candela accesa in mano.
La Cappella del Sagrato è opera di Juan Bautista Monegro, con contributi di Nicolás de Vergara, il mozzo. È completamente rivestita al suo interno da marmo proveniente dalle cave di Genova, Estremoz, Granada, San Pablo de los Montes e Urda. Il marmo fu lavorato da Bartolomé Abril e Juan Bautista Semeria. Sono stati aggiunti aggiornamenti in bronzo realizzati da Alejandro Brache e Francisco Sánchez, e dorati da Andrés Salinas. Di pianta quadrata, la cappella è coperta con una cupola su pennacchi che poggiano su archi principali costruiti da Pedro de Luargárate e Miguel del Valle. La cupola è dipinta in affresco da Eugenio Cajés e Vicente Carducho. È suddivisa in otto sezioni e alla sua base si alternano quattro tondi, ciascuno dei quali raffigura uno dei quattro Evangelisti. Ciascun pennacchio raffigura i seguenti personaggi: S. Eugenio e Isaia, S. Eladio e Davide, S. Giuliano ed Ezechiele, S. Eulogio e Salomone. Alle estremità di ciascun arco principale è raffigurato un Dottore della Chiesa: S. Agostino, S. Ambrogio, S. Gregorio Magno, S. Atanasio, S. Giovanni Crisostomo, S. Gregorio Nacianceno, S. Basilio e S. Geronimo. La Cappella accoglie inoltre numerose tele conservate negli oratori dei muri laterali, firmate da Vicente Carducho, Eugenio Cajés e Carlo Saraceni e dedicate a San Bernardo, San Eugenio, San Ildefonso e Santa Leocadia.
L’interno della cappella presenta scudi del Cardinale Bernardo de Sandoval y Rojas (1599-1618), sotto il cui mandato venne conclusa l'intera opera del Sagrato. Nella parete a est vi è l'urna-mausoleo del Cardinale, davanti a quella dei suoi padri e fratelli.
L’inaugurazione della Cappella del Sagrato, il 20 ottobre 1616, alla quale hanno assistito Filippo III, il Principe, la sua consorte, gli Infanti e Grandi del regno, fu celebrata con quattordici giorni di festa.