La Capilla del Santísimo cobija la imagen de Nuestra Señora, la Virgen del Sagrario, patrona de Toledo; así llamada por estar situada guardando el Sacrarium, lo sagrado, lugar de las reliquias de los santos que se veneran en la Catedral.
La imagen de la Patrona de Toledo, sentada sobre un trono de plata dorada, obra del florentino Virgilio Fanelli de la segunda mitad del siglo XVII, es una talla de madera de finales del siglo XII. En 1465 fue revestida de plata en su color, adornando sus ropajes con una fimbria de oro con engastes de piedras preciosas. La Virgen, sentada en posición frontal, mantiene sobre sus rodillas al Niño, igualmente chapeado de plata, que bendice con la mano derecha y sostiene una bola con cruz en la izquierda.
Según la tradición, la imagen de la Virgen del Sagrario, que fue ocultada a los musulmanes asentados en la península, fue descubierta, tras la reconquista de Toledo por los cristianos en 1085, en el Pozo de la Virgen, situado en el claustro de la Catedral, de cuyas aguas emergió por sí misma con una vela encendida en la mano.
La Capilla del Sagrario es obra de Juan Bautista Monegro, con trazas de Nicolás de Vergara, el mozo. Está totalmente revestida en su interior por mármoles procedentes de las canteras de Génova, Estremoz, Granada, San Pablo de los Montes y Urda, entre otros. Fueron labrados por Bartolomé Abril y Juan Bautista Semeria. Se añadieron además adornos en bronce, realizados por Alejandro Brache y Francisco Sánchez, y dorados por Andrés Salinas. De planta cuadrada, la capilla se cubre con cúpula sobre pechinas que descansa en arcos torales, construidos por Pedro de Luargárate y Miguel del Valle. La cúpula está pintada al fresco por Eugenio Cajés y Vicente Carducho. Está dividida en ocho secciones y en su base alternan cuatro tondos, cada uno con uno de los cuatro Evangelistas. Cada pechina está ocupada por los siguientes personajes: S. Eugenio e Isaías, S. Eladio y David, S. Julián y Ezequiel, S. Eulogio y Salomón. En los extremos de cada arco toral, un Doctor de la Iglesia: S. Agustín, S. Ambrosio, S. Gregorio Magno, S. Atanasio, S. Juan Crisóstomo, S. Gregorio Nacianceno, S. Basilio y S. Jerónimo. La Capilla acoge, además, numerosos lienzos, cobijados en los oratorios de los muros laterales, firmados por Vicente Carducho, Eugenio Cajés y Carlo Saraceni, y dedicados a San Bernardo, San Eugenio, San Ildefonso y Santa Leocadia.
El interior de la capilla presenta escudos del Cardenal Bernardo de Sandoval y Rojas (1599-1618), bajo cuyo mandato finalizó toda la obra del Sagrario. En el muro oeste está la urna-mausoleo del Cardenal, frente a la de sus padres y hermanos.
La inauguración de la Capilla del Sagrario, el 20 de octubre de 1616, a la que asistieron Felipe III, el Príncipe, su mujer, los Infantes y Grandes del reino, fue solemnizada con catorce días de fiesta.