Die Capilla del Santísimo enthält das Bildnis von Nuestra Señora, la Virgen del Sagrario (Madonna des Sanktuariums), der Schutzpatronin von Toledo; sie wird so genannt, weil sie von ihrem Standort aus das Sanktuarium, das Heiligtum, bewacht, der Ort, an dem die Reliquien der in der Kathedrale verehrten Heiligen sich befinden.
Das Bildnis der Schutzpatronin von Toledo, die auf einem Thron von vergoldetem Silber sitzt, ein Werk des Florentiners Virgilio Fanelli aus der zweiten Hälfte des 17. Jahrhunderts, ist eine Holzskulptur vom Ende des 12. Jahrhunderts. 1465 wurde sie in Silber neu bekleidet, ihre Kleidung wurde mit goldenen Fransen, eingefasst in Edelsteinen, verziert. Die in frontaler Position sitzende Jungfrau hält das ebenfalls versilberte Jesuskind auf den Knien, das mit der rechten Hand segnet und in der linken eine Kugel mit Kreuz hält.
Gemäß der Überlieferung war das Bildnis der Virgen del Sagrario vor den Mauren, die sich auf der Halbinsel niedergelassen hatten, versteckt und wurde nach der Rückeroberung Toledos durch die Christen 1085 in einem Brunnen, dem „Pozo de la Virgen“ im Klaustrum der Kathedrale entdeckt, aus dessen Wasser es selbstständig mit einer brennenden Kerze in der Hand hervorgestiegen war.
Die Capilla del Sagrario ist ein Werk von Juan Bautista Monegro nach Plänen von Nicolás de Vergara, „el Mozo“. Im Inneren ist sie vollständig ausgekleidet mit Marmor, unter anderem aus den Steinbrüchen von Genua, Estremoz, Granada, San Pablo de los Montes und Urda. Diese wurden von Bartolomé Abril und Juan Bautista Semeria behauen. Hinzugefügt wurden außerdem Bronzeverzierungen, die von Alejandro Brache und Francisco Sánchez ausgeführt worden sind, und Vergoldungen von Andrés Salinas. Von quadratischem Grundriss, wird die Kapelle von einer Pendentifkuppel bedeckt, die auf Gurtbögen ruht, konstruiert von Pedro de Luargárate und Miguel del Valle. Die Kuppel ist mit Fresken von Eugenio Cajés und Vicente Carducho ausgemalt. Sie ist in acht Abschnitte unterteilt, und an ihrer Basis wechseln sich vier Tondi ab mit je einem der vier Evangelisten. Die Pendentifs sind mit den folgenden Personen belegt: dem hl. Eugen und Jesajas, dem Hl. Euladius und David, dem hl. Julian und Ezechiel, dem Hl. Eulogius und Salomon. An den Enden eines jeden Gurtbogens einer der Kirchenväter: die Heiligen Augustinus, Ambrosius, Gregor der Große, Athanasius, Johannes Chrysostomus, Gregor von Nazianz, Basilius und Hieronymus. Die Kapelle enthält außerdem in den Oratorien an den Seitenwänden Ölgemälde von Vicente Carducho, Eugenio Cajés und Carlo Saraceni, gewidmet dem hl. Bernhard, dem hl. Eugen, dem hl. Ildefonso und der Hl. Leocadia
Im Inneren der Kapelle sind die Wappen des Kardinals Bernardo de Sandoval y Rojas (1599-1618) dargestellt, in dessen Amtszeit die Arbeiten am Sanktuarium abgeschlossen wurden. In der Westmauer befindet sich das Urnen-Mausoleum des Kardinals, gegenüber das seiner Eltern und Geschwister.
Die Einweihung der Capilla del Sagrario am 20. Oktober 1616, an der Philipp III., der Prinz, seine Gemahlin, die Infanten und die Granden des Reichs teilnahmen, wurde mit einem 14tägigen Fest gefeiert.